基因扩增PCR的扩增与克隆方法及一些使用的小建议

　基因扩增PCR主要有冰箱、超净台、加样器、混匀器、天平等。加样器、天平除了要外，还应有定期校准。试剂分装应在超净台中进行，扩增反应混合液应使用分子生物学级的，试剂制备好后应有质检：一是否有污染、二是检测试剂的扩增效果。

　　基因扩增PCR的扩增与克隆方法：

　　①引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性

　　②引物长度：15－40bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。

　　③引物的碱基尽可能随机发布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40%－75%之间。

　　④引物内部应避免形成二级结构，特别是引物的末端应避免有回文结构。

　　⑤二个引物不应有互补序列，特别是3’端应避免互补，以免形成“引物二聚体”，浪费引物。

　　⑥引物5’末端碱基无严格限制，在与模板DNA结合的引物长度足够的条件下，其5’端碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态，因此可在引物5’端加上限制性内切酶位点、启动子序列或其它序列等以便于PCR产物的分析克隆等，引物的5’端至多可加10个碱基而对PCR反应无影响。

　　基因扩增PCR的使用建议：

　　1、使用本制品时务必将Buffer反复混匀后再加，避免因组分不一导致结果差异；

　　2、配置和分装反应液时请一定使用新的（无污染的）喷头以避免污染；

　　3、如扩增条带多，可适当添加酶和dNTPs；

　　4、当多重PCR扩增产物的长度均在1kb以内时，使用3%～4％浓度的Agarosegel进行电泳分离效果。