温度控制对PCR仪的重要性

        温度的准确性是指样品孔温度与设定温度的一致性，它直接关系到实验的成败。如果排除样品加入过程中的问题，对于PCR反应而言zui重要的莫过于温度控制的准确性，由于PCR是一个几何级数扩增的过程，扩增过程中退火温度的细微变化会被放大而直接影响结果，不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度，对退火温度而言温控显的尤为重要，有时1度甚至0.5度的差异也能决定实验的成功与失败，所谓差之毫厘，谬之千里。因而对PCR扩增仪而言温度控制就意味着质量。 

        温度的均匀性是指样品孔间的温度差异，它关系到在不同样品孔进行反应结果的一致性。我们在实验中发现有时用同样的样品，同样的PCR反应程序，zui后的结果竟然差异非常明显，或许就是因为不同位置的温度不均一性所致。一些使用过早期PCR仪的脑子格外灵光的研究人员偏爱使用PCR仪中间某几个固定的孔，就是因为过往反复的教训和认真的思索得出了这样的结论，PCR仪的温度均匀性不好，特别是zui外周的样品孔情况更差，很有可能影响实验结果-即“位置的边缘效应”会影响结果的可重复性。正是这种位置效应对定量PCR的结果的影响更为明显。

        温度控制除了度，还有一个厂家喜欢大力宣传的指针-升降温的速度。更快的升降温速度，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合、反应的时间，能提高PCR反应特异性。因此从本质而言温控方式就从以前相对稳定耐用的机械式转向了升降温更快速的半导体。除了机械本身的原因，影响升降温速度的还有制作承托样品管的基座模块的材料的导热性。

        作为用户来说，当然更愿意选择升降温速度快的，这就像汽车上好看的表面配置一样容易看到，而内在的稳定性和耐用性往往是看不到的而容易被忽略。必须注意到，仪器的升降温速度和样品管中的样品的升降温速度并非同一回事，因为样品管与基座接触的紧密性、导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。现在的PCR仪一般具有两种温控模式，即模块温控模式（Block-control）和反应管温控模式（tube-control）。在模块温控模式下，机器根据探测器直接探测的温控模块（即承载样品的金属台）的温度进行控制，这种模式适用于长时间的静态孵育（如连接、 切、去磷酸化等）。反应管温控模式实际上是一种仿真试管/PCR板的温控模式，根据探测器所探测到的温控模块的温度由计算器计算出管内/PCR板孔内样品液的温度来进行控制。一般说来，管温控更为准确，因为管内样品的温度无法与温控模块同时达到预设温度。特别是PCR反应中的孵育过程一般都很短暂（30秒或更短），如果采用只有模块温控模式的话，反应混合物孵育的时间与程序设定的时间会有相当大的差距。而反应管控制的算法能自动补偿时间，而且适合各种类型的反应管，确保反应混俣物按照程序设定的时间维持预设温度。

        梯度PCR：对于一个PCR反应，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算zui适的退火温度，可是由于模版中碱基的组合千变万化，对于特殊片断，经验公式得到的数据不一定能"P"出来结果，细微的变化对结果都可能产生决定性的影响，因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题-在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在范围内按照梯度变化，根据结果，一步就可以摸索出的反应条件。不单退火温度，连变性温度和延伸温度都可以优化-对于多种聚合酶混合扩增来说这个非常重要，因为Taq和校正酶的*反应温度可能有显著差异，优化延伸温度就显得很重要。

        对于带梯度功能的PCR仪，需要考虑梯度模式下不同梯度管排间的温度均匀性和准确性，还必须考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。这种差异可能导致在梯度模式下得出的*条件与标准模式下单独做的结果出现差异。